Citocromo oxidasa y NADH citocromo c reductasa actividades fueron analizadas bioquímicamente en hiops gingiv.il> especímenes obtenidos de 22 pacientes varones (edad 23-72) sometidos a tratamiento periodontal. Histológicamente. 13 especímenes mostraron inflamación leve, mientras que el 9 mostraron respuestas inflamatorias más graves. Actividad de la citocromo oxidasa fue significativamente mayor en el levemente inflamado que en muestras de tejido marcadamente inflamados. NADH citocromo c reductasa actividad por otro lado no se alteró significativamente por el aumento del grado de inflamación. La posible implicación del efecto de la inflamación en las enzimas oxidativas se discute en relación a los cambios degenerativos y proliferativos que ocurren en ambos tipos de tejido.
Introducción
Citocromo oxidasa (E.C1.9.3.1.) Y NADH citocromo C reductasa (ECI, 6. 2. I.) se determinaron en encía humana esencialmente normal (Eichel y Sharhrik 1964), sin embargo, estos parámetros no han sido previamente analizados en relación con los efectos impuestos por la inflamación gingival. Los estudios endógenos respiración reveló que el QOj se estimula la inflamación gingival leve y depresión en muy inflamada encía (Glickman et al. 1949, Manhold Volpe y 196.1). Por otro lado estudios recientes polarographie (Zajieck y Kindlova 1972) reveló que QO_ inicial. los valores permanecieron constantes en encía humana y no se altera significativamente por el grado de inflamación. A la luz de estos puntos de vista divergentes, queremos informar sobre el efecto de la inflamación en la citocromo oxidasa y NADH citocromo c reductasa actividades en homogenados totales de encía humana.
Métodos y Materiales
Preparación de tejidos
Gingivales humanos biopsias se obtuvieron IROM 22 pacientes varones (edad 23-72), en tratamiento periodontal. Anestesia de bloqueo regional fue utilizada para evitar la infiltración del tejido. El tejido se extirpó quirúrgicamente y se corta en dos partes una de las cuales se preparó para el estudio histológico. El otro se lavó en frío 0,075 7,0 M de fosfato tampón pH. para eliminar la sangre adherida y rápidamente se congelaron a - 70 ° C en hielo seco. El vaivén / en muestras gingivales se analizaron por su actividad enzimática dentro de un día después de su eliminación. Homogeneizados gingivales se prepararon por una modificación de los métodos (Hoober & Bernstein 1966) utilizado tor la homogeneización de la piel de rata. El tejido congelado gingival (25-5U mg de peso húmedo.) Se sumergió en nitrógeno líquido, (-270'C) durante 3 minutos, y se pulverizan para pequeños fragmentos granulares. Los fragmentos gingivales se homogeneizaron en tampón frío en Diez homogeneizadores de vidrio Broeck de tierra que se molieron para encajar con un aclaramiento de la tolerancia o ((1,1-0,15 mm. Las actividades enzimáticas se determinaron inmediatamente después de la homogeneización del tejido.
Enzyme Analysis
Citocromo oxidasa (EC 1. 9. 3. 1.) (Wainio et al. 1951) se determinó espectrofotométricamente siguiendo hy la oxidación de ditionito de citocromo c reducido en I * al 25 ° C en un Modelo 2400 Gilford espectrofotómetro. En experimentos nil la tasa de auto-oxidación de lerrocytoehrome C antes de la adición de la enzima era insignificante. Los E.VHI "", los valores de absorbancia para la solución de homogeneizado fueron en su mayor parte insignificante (0,0% en 16 muestras), y en caso de detectarse que oscilaron entre 0, (12 a 13.0 ";. Enzimática del valor El valor promedio de sedimentación fue 2,5 ± 0,9 ci para las 22 muestras que fueron analizadas. valores de sedimentación se determinaron por re-reducción de los medios de reacción con ditionito exceso, resuspendiendo el homogeneizado en el medio de reacción, y tras el cambio en la absorbancia óptica a Ejaonni vs-tiempo gráficamente. La valores de sedimentación se resta del valor de absorbancia total observada en los ensayos de enzimas afectadas, y las actividades específicas se determinaron a partir de los valores corregidos La mezcla de reacción contenía:.. 75 mM KH .. PO |-Na, HPO4 tampón pH 6,75 5,6. . uM citocromo c y (25-150) proteína plantilla (homogenale) en un volumen final de 300 u citocromo concentración c se determinó a partir del coeficiente de extinción milimolar del citocromo c H-,, -,;, t] ll = 18,5 mm ' cm 'para el reducido menos oxidado c cvtoehrome.
NADH citocromo c reductasa. NADH citocromo c reductasa (EC 1. 6. 2. 1.) (Jeng et al. 1968) se determinó siguiendo la reducción del citocromo c en Er,, TNM a 25'C. El coeficiente de extinción milimolar utilizado para el citocromo c en el ensayo de la citocromo oxidasa se utilizó para este ensayo. El sistema de ensayo contenía:.. 33 mM KHiPOi-NaoHPO, pH 7,75 buffer, S.2 FTM citocromo c, 3,0 mm de KCN, 85 / NADH LIM ** y (25-150) ^ g proteína (homogeneizado) en un volumen final de 300 II.
Actividades específicas
Las actividades específicas se expresan como nanomoies de citocromo c oxidado (citocromo oxidasa) o reducida (NADH citocromo c reductasa) por mg de proteína por min.
Determinación de proteínas
Los homogenizados de tejido (10-20 / A) se digirieron en 0,05 N NaOH (concentración final) durante una hora a 25 ° C, y se analizaron para la proteína por el método de Lowry et al .. (1951). *** Albúmina cristalino se utiliza como estándar.
Estadística
La media, la desviación estándar y el error estándar se determinaron para cada grupo. Los valores que excedan los límites ± 1,96 SD fueron descartados. La diferencia entre cada grupo se analizó mediante la "t de Student" prueba y todos los valores de p. pulverización de la Prueba (tema, descongelación y homogeneización posterior parece alterar adecuadamente las células. para esta interpretación reside en la observación de que la distribución de NADH citocromo c reductasa tanto en encía inflamada y ligeramente inflamado notablemente no varió significativamente. Si la disminución de los citocromo oxidasa fue influenciado por nuestras técnicas de preparación de tejidos, resultados similares se observan en las distribuciones de NADH citocromo c reductasa. La cantidad de establecerse en nuestro sistema de ensayo resultó ser insignificante en su mayor parte y no se podía dar cuenta de la marcada disminución en actividad de la citocromo oxidasa observado en la encía inflamada notablemente.
La elevada actividad oxidasa cylochiomc observada en nuestro estudio coincide con las observaciones formuladas por Manhold y Volpj (1963) en sus estudios endógenos QcK de respiración de encía humana ligeramente inflamada y proliferar. El aumento en la calidad de vida> y la citocromo oxidasa en encía pueden reflejar un aumento mitocondrial enlace de alta energía (ATP), que se requiere para sostener los procesos altamente synthelic asociados con la síntesis de ADN, mitosis, así como la proliferación celular. Otra prueba de las mayores necesidades bioencrgelic en el pre-proliferación y las etapas de desarrollo de las células proliferativas de la observación de que el aumento de la calidad de vida. (Respiración endógena) (Glickman et al. 1949), y la citocromo oxidasa (Fine 197 (1) alcanza picos de actividad en un momento en aumentos importantes en el índice de proliferación y mitolic (epitheiialization) se producen en la regeneración gingival y heridas de la piel. Por disminución IHE otro lado agudo en la citocromo oxidasa y Qoo endógena observada en notablemente inflamado (Volpe y Manhold 1963, Giickman et al. 1949) gtngiva parecen ser reflejos de los cambios que se producen dentro de las mitocondrias, así como otros componentes subcelulares durante una destrucción significativa del tejido gingival. Fuimos incapaces de delect un aumento de la citocromo oxidasa en la encía inflamada y marcadamente proliferando. aunque los incrementos en la QO endógeno. fue detectado por Giickman et al. (1949) en este tipo de patología gingival. Sin embargo, es concebible lhal como inflamación disminuya , una fase preproliferativa (fase S de la mitosis) se produce dentro de las células que migran en el borde de la herida que requiere un aumento de la síntesis de ATP. Posteriormente un aumento en la calidad de vida endógeno. también se observa. Nuestros datos citocromo oxidasa, y hacer los datos reportados por QOj respiración endógena no coincide con la QO polarográfico. observaciones formuladas por Zajieek y Kindlova (1972), quien reportó el tailandés QO_ inicial> valores se mantuvieron constantes en encía humana, y no fueron significativamente alterados por el grado de inflamación.
NADH citocromo c reductasa actividad no se alteró notablemente por el grado de inflamación en la encía humana. Nuestros datos para personas paralelo encía la observación hecha por Eichel y Shahrik (1964), para el consumo humano no inflamada encía. NADH cylochrome c reductasa actividad se encontró que era significativamente mayor que la oxidasa cytohrome en nuestros estudios que se correlaciona con la observación hecha por Eiehcl y Shahrik
